(untitled) (Estima – Brazilian Journal of Enterostomal Therapy, 2016)
RESUMO O objetivo deste trabalho foi avaliar a ação da fi cocianina na terapêutica de lesões cutâneas induzidas em ratos envelhecidos. Utilizaram-se 40 ratos machos envelhecidos com lesões de pele induzidas, divididos em 4 grupos: G1 (Ficocianina 10%); G2 (Ficocianina 20%); G3 (Ficocianina 30%) e G4 (Controle positivo - Kollagenase®). Essas lesões foram analisadas quanto à contração cicatricial, quantidade de colágeno total, fi brose e células infl amatórias. Para análise estatística, foram utilizados o software Bioestat 5.0 e a comparação entre os tratamentos e, entre os parâmetros, foi utilizado o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis, em nível de signifi cância de 5%. Os resultados com a pomada fi cocianina nas diferentes concentrações não apresentaram diferença estatística signifi cativa quando comparados aos resultados da pomada Kollagenase®, porém, a pomada fi cocianina na concentração de 30% mostrou resultado semelhante à pomada de referência. Conclui-se que o uso da fi cocianina em uma concentração de 30 % contribuiu positivamente para cicatrização de feridas cutâneas em ratos. DESCRITORES: Cicatrização. Ficocianina. Envelhecimento. INTRODUÇÃO A pele é um órgão complexo, no qual a interação celular e molecular reguladas de modo preciso governam muitas das agressões provindas do meio ambiente. É constituída por vários tipos de células interdependentes responsáveis pela manutenção da sua estrutura normal. Com o envelhecimento cronológico cutâneo, ocorre a modi cação do material genético por meio de enzimas, alterações proteicas e o decréscimo da proliferação celular1. Esses eventos promovem a perda de tecido, da elasticidade e da capacidade de regular as trocas gasosas. A replicação do tecido se torna menos e ciente. As oxidações químicas e enzimáticas envolvendo a formação de radicais livres (RL) aceleram o processo de senescência2. Com o envelhecimento, ocorrem modi cações nas células, resultando em uma diminuição da imunidade devido à redução das células de Langerhans, aumentando, dessa forma, o risco de lesões na pele. Aliado a isso, ocorre também a diminuição dos melanócitos, o que reduz a proteção aos raios solares, a diminuição da produção de suor pelas glândulas sudoríparas, (resultando numa menor capacidade de termorregulação), bem como a redução da vascularização e da produção de colágeno3. Uma das consequências das lesões de pele é a prevalência da polifarmácia, aumentando o risco de reações autoimunes, porque a administração concomitante de vários medicamentos pode criar uma sensibilidade muito maior para erupções da droga, podendo simular outras afecções cutâneas4. Nesse contexto, a busca de novas alternativas para o tratamento de lesões de pele torna-se bastante importante. Existem perspectivas de desenvolvimento de novas tecnologias que visam a acelerar o processo cicatricial e reduzir as complicações que essas lesões podem acarretar5. A cicatrização é reconhecida como um processo sistêmico que consiste em uma complexa sequência de eventos coordenados e desencadeados pelo organismo que objetiva reconstruir o tecido lesado sendo este substituído por tecido conjuntivo vascularizado broso5,6. Inicia-se com resposta in amatória caracterizada pelo aumento do uxo sanguíneo, permeabilidade capilar, migração de leucócitos para a região lesada e extravasamento de plasma, formando o exsudato in amatório7,8. A cicatrização das feridas de espessura parcial ocorre por regeneração das células epiteliais na superfície da ferida, essas células migram em direção à área lesionada, proliferando- se por mitose e incorporando-se à camada epitelial9. Já, nas feridas de espessura total, o processo de cicatrização ocorre por segunda intenção e é bem mais complexo, envolvendo uma sequência de eventos moleculares e celulares de forma ordenada e contínua10. Essa sequência, sob o ponto de vista morfológico, é classi cada em três fases: in amatória, proliferativa e de remodelamento11. A fase in amatória e de hemostasia representa a primeira fase de qualquer processo de cicatrização, inicia-se com a ruptura de vasos sanguíneos e o extravasamento de sangue e caracteriza-se pela participação ativa de inúmeras células e fatores do sistema imunológico12. Essa fase tem duração de 48 a 72 horas, com então aparecimento de dor, calor, rubor e edema, sinais clássicos da in amação13. A segunda fase é a broblástica, também chamada de fase reconstrutiva ou proliferativa, denominada dessa forma porque, nesse período, a atividade predominante é a mitose celular. Essa fase se estende de 12 a 14 dias6,9. As principais características nessa fase são a formação do tecido de granulação, neoangiogênese, deposição de colágeno, contração da ferida e reepitelização. Para a síntese desses componentes, os principais agentes estimulantes são as células endoteliais, os broblastos e os queratinócitos3 . A terceira fase é a de remodelamento, também denominada por alguns autores de fase de maturação, e consiste na reorganização das bras de colágeno e na substituição do colágeno tipo III (imaturo) depositado de forma desorganizada pelo colágeno tipo I (maduro) disposta de forma organizada3 . Em diversos setores da área de saúde, o tratamento de feridas vem sendo um tema em destaque e a preocupação na busca de produtos que promovam a cicatrização é uma constante. Essa é uma prática milenar que, nos primórdios da civilização, estava intimamente ligada a costumes e hábitos populares e, com o desenrolar da história e do desenvolvimento tecnológico, conquistou seu merecido cunho cientí co9 . Dentre as novas tecnologias, encontra-se a Ficocianina, um pigmento extraído da Micoalga Spirulina platensis . Seu peso seco pode chegar a 20%14 , é considerada a principal responsável pela atividade antioxidante e apresenta capacidade de ativar o sistema imunológico15 . O uso desse pigmento pode acelerar os processos de cicatrização de feridas, haja vista a sua riqueza em vitamina A e capacidade bactericida, pela presença de 2,4,4 tricloro-2 hidroxi-difenil-éter, o qual é utilizado no tratamento de processos infecciosos16 . O potencial terapêutico da Ficocianina tem sido relatado para ns terapêuticos em humanos e também em animais17 . A microalga possui e ciente atividade antiviral contra vários vírus patógenos e tem também a capacidade de aumentar a resposta imunológica e estimular a função dos macrófagos18 . Existem muitas informações acerca do uso da Ficocianina como medicamento, entre elas, cita-se o poder de cicatrização, mas ainda são insu cientes para sua comprovação. Ao partirmos do pressuposto que a Ficocianina acelera o processo de cicatrização em lesões de pele, este estudo possui o seguinte objetivo: veri car a ação da cocianina na terapêutica de lesões cutâneas induzidas em ratos envelhecidos com relação à contração cicatricial, quantidade de colágeno total, brose e células in amatórias em comparação com produto de referência – Kollagenase®. MÉTODO Os experimentos foram realizados no Biotério Central e no Laboratório de Bioquímica e Histologia do Instituto de Ciências Biológicas (ICB) da Universidade de Passo Fundo (UPF). Foram adotados os Princípios Éticos em Experimentação Animal, preconizados pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA), instituição liada ao International Council for Laboratory Animal Science e a Legislação Brasileira de Animais de Experimentação, Lei Federal n.º 6.638 (1979). A Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade de Passo Fundo (CEUA-UPF) aprovou o projeto desta pesquisa com o parecer 007/2011, com registro de número 002/2011 na CEUA, que diz respeito à vida dos animais utilizados. Foram utilizados 40 ratos (Wistar hannover ) machos, nascidos e mantidos no Biotério Central da UPF, com idade aproximada de 400 dias, alimentados com ração e água ad libitum e com ciclo claro-escuro de 12 horas. Eles foram divididos em quatro grupos com nº de 10 animais, e cada grupo recebeu um tipo de tratamento conforme segue: • grupo 1 - G1 (Ficocianina 10%); • grupo 2 - G2 (Ficocianina 20%); • grupo 3 - G3 (Ficocianina 30%) e • grupo 4 - G4 (Controle positivo – Kollagenase®) pomada de referência. Durante todo o período de estudo, os animais foram mantidos em gaiolas individuais, identi cadas e acomodados sobre estantes horizontais. A pomada Kollagenase®, utilizada no grupo controle, foi usada como pomada de referência comercial no efeito cicatrização, a qual possui Registro no Ministério da Saúde sob nº 1.0298.0049, um brinolítico de uso adulto com ações terapêuticas cicatrizantes. A Ficocianina foi obtida no Laboratório de Bioquímica de Alimentos e de Bioprocessos da UPF. Esse pigmento foi extraído da cianobactéria Spirulina platensis , a qual foi procedente do Laboratório de Engenharia Bioquímica da Fundação Universidade Federal de Rio Grande – FURG. A manipulação dessa pomada foi realizada pela farmácia de manipulação Artesani da cidade de Erechim/RS, Brasil. Os excipientes para formulação da pomada foram o extrato de Ficocianina nas porcentagens utilizadas para cada grupo, 10, 20 e 30%, as quais foram adicionadas em creme base na quantidade su ciente para completar a fórmula (QSP). Os animais foram submetidos a jejum de 2 horas prévias ao procedimento cirúrgico. Para os procedimentos cirúrgicos, os ratos, após pesados, foram anestesiados com o uso de Zoletil 50 mg, sendo administrado via intramuscular na dose de 40 mg/kg de peso corporal no músculo da panturrilha dos ratos. A técnica operatória, após tricotomia, consistiu em excisão de espessura total de pele com 20 mm de circunferência, utilizando-se um punch para demarcar a área e auxílio de um bisturi. A hemostasia foi realizada por compressão digital, utilizando-se gaze esterilizada. Para a aplicação das pomadas nos diferentes grupos, foi realizada a limpeza da lesão com soro siológico (NaCl 0,9%) em jato na temperatura ambiente, o qual foi feito através de uma seringa de 20 mL com uma agulha 40x12 mm na ponta9 . Na sequência, foram aplicadas 0,5 ml da pomada utilizada em cada grupo, quantidade su - ciente para cobrir toda a lesão que foi mantida aberta. Esse procedimento foi realizado durante 18 dias consecutivos uma vez por dia. A contração cicatricial foi avaliada através da análise computadorizada de fotos digitais padronizadas. A documentação fotográ ca foi feita logo após o procedimento cirúrgico e em diferentes tempos do pós-operatório (po): 0º po; 4º dia po; 12º dia po; 18º dia po. As imagens das lesões foram digitalizadas e analisadas pelo programa Imagem Tool e sua área quanti cada em centímetros quadrados. Cada imagem avaliada foi calibrada pelo programa, utilizando a régua adjacente à ferida. A seguir, com auxílio de um mouse, procedeu-se o contorno manual da imagem. Astaxas de contração cicatricial das feridas excecionais foram obtidas subtraindo-se a área cruenta inicial do pós-operatório imediato, em cada animal, pela área cruenta em cada tempo pós-operatório. As biópsias foram realizadas no sétimo dia de pós-operatório por excisão da área total da lesão e, em seguida, foi praticada a eutanásia do animal biopsiado. As amostras de feridas foram colocadas em frascos com formol a 10%, identi cados e armazenados em temperatura ambiente. Os40casos foram processados e confeccionadas lâminas coradas pela Hematoxilina-eosina e pelo Picro-sirius. Para análise estatística, foi utilizado o software Bioestat 5.0 e, para realizar a comparação entre os tratamentos e entre os parâmetros, foi utilizado o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis, em nível de signi cância de 5%. Comoteste post hoc , usou-se o método de Dunn. Utilizou-se estatística descritiva para identi cação de média e desvio padrão. As lâminas foram analisadas por médico patologista, o qual não obteve acesso a qual grupo a lâmina pertencia, sendo que cada lâmina foi identi cada por número arábico para a descaracterização. Foram analisados os seguintes parâmetros: In ltrado In amatório, Colágeno e Fibrose. Cada parâmetro foi categorizado como: 0=sem valor para o parâmetro; X = pouco valor para o parâmetro; XX = valor moderado para o parâmetro e XXX = valor intenso do parâmetro. Todos os casos foram analisados no mesmo microscópio Nikon Eclipse E200, com objetivas E Plan 4X, 10 X, 20 X, 40 X. Portanto, os valores obtidos na análise dos parâmetros foram marcados como valores inteiros 0, 1, 2 e 3, respectivamente aos valores 0, X, XX e XXX. RESULTADOS E DISCUSSÃO A Tabela 1 apresenta a média da avaliação da contração cicatricial nos 4 grupos das feridas induzidas nos ratos no dia 1, 4, dia 12 e dia 18. Observa-se, na Figura 1, que o comportamento cicatricial das feridas tratadas por qualquer uma das formulações declinou em tamanho na mesma proporção. Exceção nesse comportamento pode ser observada para Ficocianina a 10%. A Figura 2 retrata as quanti cações do colágeno total, fibrose e células inflamatórias, resultados da análise no sétimo dia, indicando os valores dos parâmetros. O valor zero indica que não há valor para o parâmetro; 1 = pouco valor; 2 = valor moderado; 3 = valor intenso. Para compor os valores de cada parâmetro, entre os tratamentos, foi utilizado o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis , em nível de signi cância de 5%. Observa-se que não existe diferença estatisticamente signi cativa entre os valores dos parâmetros, Colágeno, In amação e Fibrose conforme a Tabela 2. A Figura 3 apresenta a distribuição dos valores médios dos parâmetros de cada tratamento, bem como seus respectivos desvios-padrão. Apesar de o teste aplicado para comparações dos valores dos parâmetros de cada tratamento não ser paramétrico (Kruskal-Wallis ), ou seja, não se basear na média, os pesquisadores optaram por mostrar o comportamento médio com seus respectivos desvios-padrão, uma vez que é uma medida estatística de mais fácil visualização. Osvalores do desvio-padrão são relativamente altos, conforme observados na Figura 3, em particular para a in amação. Nesta pesquisa, utilizou-se o rato da linhagem Wistar , pois, biologicamente, apresenta características facilitadoras com relação a manuseio e acompanhamento, além de boa resistência à manipulação, agressão cirúrgica e baixo custo. Optou-se por utilizar ratos machos, pois variações dos ciclos hormonais das fêmeas poderiam interferir no mecanismo do processo de cicatrização19 . Um estudo20 evidenciou uma desaceleração da atividade metabólica dos broblastos com o envelhecimento e estes perderam a sua capacidade de aderir às bras de colágeno, limitando a possibilidade de organização do tecido dérmico. A quantidade de colágeno total apresenta seu primeiro pico de produção por volta do 7º dia após a lesão, continuando em ascensão até o 14º dia e, após, com o decorrer da fase de remodelamento, é estabelecido um equilibro entre a síntese e a degradação das bras colágenas21 . No presente experimento, foi observada maior quantidade do colágeno total das feridas excecionais do grupo G2 e G3, mostrando que os grupos tratados com Ficocianina em maior concentração apresentam-se em fase mais adiantada do processo de cicatrização da lesão. Os extratos testados de Spirulina , que dá origem a Ficocianina, revelaram a presença de avonóides, alcalóides e triterpinoides. Os avonóides são conhecidos por reduzir a peroxidação lipídica não só através da prevenção ou inibição da peroxidação lipídica, acreditando-se que seja para aumentar a viabilidade de bras de colágeno através da promoção da síntese de DNA. Assim, a propriedade de cicatrização de Spirulina , pode ser atribuída aos toconstituintes presentes nela22 . No presente estudo, os G2 e G3, apesar de não apresentarem valores estatísticos signi cativos, mostraram valores semelhantes e com menor número de células in amatórias no sétimo dia quando comparados com o G1, podendo-se, dessa forma, concluir que, com relação à reação in amatória, esses 2 grupos estão mais próximos do resultado da pomada de referência (G4). Já no grupo G1, pode-se concluir que houve um atraso na primeira fase da cicatrização devido à presença de maior número de células in amatórias no sétimo dia. Um estudo comparativo entre Extrato de Levedura, Levedura de Cerveja e Spirulina como complemento na dieta de peixes com objetivo de avaliar o crescimento e resposta hemato-imunológica de peixes evidenciou que a Ficocianina possui e ciente atividade antiviral contra vários vírus patógenos e tem capacidade de aumentar a resposta imunológica e estimular a função dos macrófagos18 . Em recente pesquisa23 realizada em ratos com lesões de pele induzida, a aplicação de Ficocianina acelerou a primeira fase da cicatrização de feridas, rea rmando os achados deste estudo. Durante o 2º e 3º dias pós-trauma, os broblastos agem principalmente na proliferação e migração celular, formando brose24 . Com estímulos adequados, os brócitos revertem-se para o estado de broblastos e mio broblastos, reativando sua capacidade de síntese24 . Neste estudo, observou-se maior número de brose no grupo tratado com pomada em maior concentração de Ficocianina (G3), o que sugere que em tal grupo, no 7º dia pós-operatório, a fase de proliferação celular está mais adiantada do que nos grupos tratados com pomada em menor concentração de Ficocianina (G1 e G2). Em estudo23 realizado para examinar a propriedadede cicatrização de Ficocianina em relação à proliferação de brócitos em ratos, foi observado que a referida substância aumentou a proliferação destes de maneira signi cativa. Nesse mesmo estudo, os autores salientam que os dados tangenciam o uso terapêutico da Ficocianina como agente cicatrizante de feridas. Neste estudo, a análise das áreas cruentas das feridas excisionais mostrou haver maior taxa de contração, levando a valores menores de área cruenta nos grupos tratados com pomada em maior concentração de Ficocianina, ou seja, 30%. Presente no tecido de granulação, o mio broblasto é o principal tipo celular envolvido no reparo tecidual através da deposição de componentes da matriz extracelular (tenascina, bronectina, metaloproteinases e colágenos I e III)25 . As melhores taxas de fechamento das feridas dos grupos tratados com a pomada de Ficocianina 30% podem ter relação com o número e/ou o aumento da função dos mio broblastos. As feridas não cicatrizadas geram problemas socioeconômicos, com diminuição da produtividade e da qualidade de vida dos indivíduos acometidos, o que pode ser agravado se não for tratado com uma terapia tópica adequada21 . As limitações deste estudo referem-se às características instintivas e anatômicas dos animais, não sendo possível manter as lesões fechadas com gaze, o que diminuiu um pouco o tempo de umidade oferecida ao leito da ferida, bem como a absorção da exsudação quando necessário. CONCLUSÃO Conclui-se que o uso da pomada de Ficocianina na concentração de 30% mostrou resultado semelhante à pomada de referência – Kollagenase®, sendo capaz de promover a contração mais rápida de feridas pela aceleração da primeira fase da cicatrização e reação in amatória, maior concentração de brose e produção de colágeno total se comparada à pomada de referência no mercado. É válido ressaltar que a Ficocianina acelera o processo cicatricial, caracterizando-se como um tratamento e ciente e de baixo custo. Sugere-se novas pesquisas para possível aplicação em seres humanos, o que possibilitaria minimizar o sofrimento de pessoas com lesões cutâneas e aprimorar a terapêutica disponível com melhor custo aos cofres públicos. REFERÊNCIAS 1. Fontes IJG. Antioxidantes como substâncias cosmetologicamente activas [dissertação]. Lisboa: Universidade Lusófona de Humanidades e Tecnologias; 2013. 2. Santos MP. O papel das vitaminas antioxidantes na prevenção do envelhecimento cutâneo. 2013 [citado em 2014 Ago 18]. Disponível em: http://bibliodigital.unijui.edu. br:8080/xmlui/bitstream/handle/123456789/1571/TCC%20 Mirelli%20P%20dos%20Santos.pdf?sequence=1 3. Cohen VDF, Prazeres SJ, Silva ACB. Aspectos morfológicos do tecido tegumentar. In: Prazeres SJ (org.). Tratamento de feridas: teoria e prática. Porto Alegre: Moriá; 2009. p. 5-36. 4. Farage MA, Miller KW, Berardesca MH, Maibach HI. Clinical implications of aging skin: cutaneous disorders in the elderly. Am J Clin Dermat. 2009;10(2):73-86. 5. 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